- 用于臨床體外診斷（膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法）；
- 用于生物醫(yī)藥研發(fā)（基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā)）
- 用于腫瘤研究、免疫學(xué)研究等基礎(chǔ)研究；申請(qǐng)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的發(fā)明專利及科研獎(jiǎng)項(xiàng)；
- 拓展研究思路、發(fā)表國際知名學(xué)術(shù)刊物。
- 羊駝/駱駝背景清晰：羊駝/駱駝健康適齡，可提供空白羊駝/駱駝進(jìn)行免疫。
- 技術(shù)成熟：抗體庫容量可以達(dá)到109,VHH抗體片段有效插入率﹥99%，并可以進(jìn)行高通量篩選。
- 大規(guī)模制備：可利用原核/真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)克級(jí)以上的抗體診斷原料。
| 步驟 | 周期 | 交付材料 |
| 1.動(dòng)物免疫 | ||
| A.5次動(dòng)物免疫 B.效價(jià)檢測(cè) C.PBMC分離 D.RNA提取 E.cDNA制備 |
92天 | 5次免疫效價(jià)檢測(cè)數(shù)據(jù) 5次免疫之后的cDNA |
| 2.構(gòu)建噬菌體抗體庫 | ||
| A.利用免疫羊駝的cDNA，擴(kuò)增出VHH基因片段，構(gòu)建M13單鏈絲狀噬菌體展示納米抗體免疫文庫; B.抗體庫質(zhì)量： （1）VHH抗體片段有效插入率﹥99%， （2）抗體庫容量達(dá)到109 C.從文庫中隨機(jī)挑取96個(gè)克隆，對(duì)其中30個(gè)克隆測(cè)序，分析VHH抗體片段的多樣性和正確率，保證正確率≥80%，另外提供30個(gè)克隆用于測(cè)序驗(yàn)證； |
4-6周 | 提供質(zhì)檢報(bào)告與抗體庫 ①完整的項(xiàng)目報(bào)告和原始數(shù)據(jù)，報(bào)告需包含實(shí)驗(yàn)流程、分析評(píng)估實(shí)驗(yàn)的主要 操作步驟、以及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果； ②共30個(gè)文庫隨機(jī)克隆的甘油菌和測(cè)序引物； ③噬菌體展示納米抗體免疫文庫的Kit（包含文庫甘油菌1ml × 10支和文庫噬菌粒質(zhì)粒10 μg）； |
| 3.抗體庫篩選 | ||
| A.篩選方案確定：根據(jù)項(xiàng)目實(shí)際情況，選擇不同的篩選方案，如競(jìng)爭(zhēng)篩選，固相篩選，液相篩選，細(xì)胞篩選，負(fù)篩選等篩選方法。 B.淘選： 對(duì)抗原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析驗(yàn)證，并進(jìn)行生物素標(biāo)記；針對(duì)生物素化靶點(diǎn)蛋白，利用鏈霉親和素預(yù)包被的ELISA plates，淘篩免疫文庫；抗原施壓法進(jìn)行2-3輪淘篩，確定充分富集且靶點(diǎn)篩選組的滴度要遠(yuǎn)高于對(duì)照篩選組。 C.結(jié)合篩選：選擇從Output克隆中，分別挑取940個(gè)單克隆進(jìn)行陽性克隆鑒定。經(jīng)培養(yǎng)和phage rescue后，進(jìn)行monoclonal phage ELISA檢測(cè)。 D.測(cè)序分析:鑒定出抗原結(jié)合強(qiáng)陽性的VHH抗體克隆，測(cè)序分析，比對(duì)序列制作進(jìn)化樹，選擇序列獨(dú)特的克?。?br> E.表達(dá)驗(yàn)證：少量表達(dá)陽性VHH克隆，利用soluble ELISA檢測(cè)對(duì)靶點(diǎn)抗原的特異性結(jié)合能力； |
6-8周 | 10個(gè)以上的特異性克隆 |
| 4.納米抗體表達(dá)純化 | ||
| A.將納米抗體基因克隆至真核或原核表達(dá)載體。 | 2周 | 高純度納米抗體100-500ug |
| 5.親和力測(cè)定 | ||
| 采用Biacore 測(cè)定抗體的親和力/ 采用Nicoya LSPR 測(cè)定抗體的親和力/ 采用Fortebio octet 測(cè)定抗體的親和力 |
1周 1周 1周 |
親和力測(cè)定數(shù)據(jù) |
| 6.納米抗體人源化（通過自主開發(fā)軟件AbsYs分析抗體可變區(qū)并進(jìn)行抗體人源化設(shè)計(jì)。） | ||
| A.識(shí)別FR、CDR、關(guān)鍵殘基、PTMs。 B.通過同源比對(duì)，考慮可變區(qū)一致性及相似性、關(guān) 鍵殘基、PTMs、穩(wěn)定性等因素，選擇更好的人源抗 體Germline FR作為模板，與羊駝CDR 重組，設(shè)計(jì)初 始人源化抗體。 C.分析抗體序列和結(jié)構(gòu)，確定需要回復(fù)突變的關(guān)鍵 殘基，設(shè)計(jì)不同數(shù)量的回復(fù)突變VH。 D.將人源化基因克隆至真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293瞬時(shí) 表達(dá)獲得100-500ug 純化抗體。 E.結(jié)合活性及親和力檢測(cè)。 |
6-8周 | 至少一個(gè)人源化抗體（親和力、表達(dá)量與原納米抗體相當(dāng)） |
本項(xiàng)目共免疫2只羊駝， 經(jīng)過5次免疫后檢測(cè)抗血清效價(jià)，結(jié)果顯示，A, B-1（Fc tag）蛋白免疫動(dòng)物后均產(chǎn)生了正常的免疫應(yīng)答。重鏈抗體的效價(jià)較總IgG的效價(jià)低，4免后效價(jià)達(dá)到最高，建議結(jié)束免疫階段實(shí)驗(yàn)，進(jìn)入建庫篩選階段。