01. 背景介紹

因此需要開發(fā)新型納米材料作為識別分子模擬抗體并與靶株結(jié)合。例如，利用有機框架作為捕獲元素，可以有效地提高ICA系統(tǒng)的靈敏度。引入對巰基苯基硼酸修飾的納米材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)探針，可以表現(xiàn)出良好的細菌捕獲能力。同時，二維納米材料，如過渡金屬二硫族化合物和石墨烯，具有較大的表面積和較強的表面吸附能力。這些二維納米片可以通過其大表面，依靠范德華力、靜電和疏水相互作用非特異性地結(jié)合細菌。因此，這些獨特的性質(zhì)使這些二維納米材料有可能在ICA中取代傳統(tǒng)探針作為抗體替代者。

納米酶，是具有類酶特性的納米材料，是優(yōu)秀的信號報告分子而被廣泛應(yīng)用于生物傳感檢測，治療等領(lǐng)域。MnO2作為一種有前途的納米材料因其形貌多樣性和制備簡單，獨特的光學(xué)性質(zhì)、吸附能力和優(yōu)異的催化性能得到廣泛研究，因此二維MnO2 NSs是無標(biāo)記ICA的理想標(biāo)簽。

本研究首先利用具有良好細菌吸附能力、良好光信號和催化活性的MnO2 NSs作為無捕獲抗體探針，設(shè)計了一種新型的無標(biāo)記雙信號ICA，用于靈敏快速檢測腸炎沙門氏菌(S. enteritidis)。眾所周知，腸炎沙門氏菌是致病菌引起的傳染病的主要危險因素之一。一般來說，它可以通過食用受污染的動物源性食品(如肉、蛋和牛奶)傳播給人類，導(dǎo)致數(shù)百萬人患病，有時甚至造成嚴(yán)重和致命的后果。在這項工作中，僅使用一個單抗就能成功檢測出腸炎沙門氏菌，具有良好的靈敏度和選擇性。通過一步合成二維MnO2 NSs，可以同時提供三個功能:(1)作為細菌捕獲的抗體替代者，(2)在ICA中提供強大的視覺信號，(3)通過浸泡放大模擬酶氧化酶活性產(chǎn)生額外的催化信號。因此，它已被選擇并引入ICA作為檢測食源性病原體的理想標(biāo)簽。如方案1所示，在檢測過程中，在測試樣品中加入適量的MnO2 NSs，經(jīng)過一段時間的孵育后，MnO2 NSs會吸附在目標(biāo)菌表面形成細菌材料復(fù)合物。然后，在毛細管力的作用下，復(fù)合物會從樣品墊遷移到NC膜上。當(dāng)復(fù)合物移動到T線時，預(yù)涂的抗S. enteritidis抗體會特異性結(jié)合檢測靶點，并在T線上富集，形成棕色條帶。因此，測試物質(zhì)中目標(biāo)細菌越多，T線顏色越深，呈正線性關(guān)系。此外，由于MnO2 NSs具有類似氧化酶的酶活性，TMB會被氧化為ox-TMB，形成藍帶，從而提高檢測靈敏度。

要點: 通過透射電鏡(TEM)對制備的MnO2 NSs形貌進行表征，可以看出MnO2 NSs為二維片狀結(jié)構(gòu)，平均尺寸約為250 nm(圖1a和圖1b)。MnO2納米顆粒表面元素組成和化學(xué)狀態(tài)的XPS全光譜如圖所示，揭示了MnO2 NSs中存在Mn和O元素。此外，Mn 2p光譜的高分辨光譜(圖1e)在653.9 eV和642.0 eV處的兩個主峰分別歸屬于Mn 2p1/2和Mn 2p3/2軌道的Mn3+和Mn4+，這與之前報道的發(fā)現(xiàn)一致。在較高的Mn3+比例下，有更多的氧空位，使得制備的MnO2 NSs具有較高的催化活性。用x射線衍射(XRD)測定了合成的二氧化錳NSs的晶體結(jié)構(gòu)。如圖1c所示，XRD譜圖顯示，在22.01、37.32、39.69、56.03和65.81?的2θ處分別形成(110)、(101)、(200)、(211)和(002)，與γ-MnO2的特征峰一致(PDF# 65-2821)。以上結(jié)果證明了二氧化錳納米顆粒的成功制備。圖1g顯示，大量MnO2 NSs在腸炎沙門氏菌表面結(jié)合。這些結(jié)果表明MnO2 NSs具有與腸炎沙門氏菌相互作用的能力。圖1i顯示了MnO2 NSs、S. enteritidis和MnO2 NSs- S. enteritidis的電位。顯然，與腸炎沙門氏菌結(jié)合后，電位從-31.77變?yōu)?23.50 mV。

要點：所制備的二氧化錳納米酶的類似氧化酶的催化活性是實現(xiàn)原位放大比色信號的關(guān)鍵性質(zhì)。圖片顯示MnO2 NSs氧化TMB生成藍色氧化產(chǎn)物，在650 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰(紅線)。同時，在沒有MnO2 NSs的情況下，TMB沒有被氧化，溶液保持無色，在600-700 nm處沒有出現(xiàn)峰(藍線)。進一步，從圖2b可以看出，隨著MnO2 NSs濃度的增加，催化體系的吸光度逐漸增大，納米酶的濃度與吸光度呈線性關(guān)系(圖2c)。這些結(jié)果表明所制備的MnO2 NSs具有類似氧化酶的活性，可以催化TMB生成ox-TMB并觸發(fā)視覺顏色信號。不同pH值下MnO2 NSs的催化能力不同。如圖2d所示，當(dāng)緩沖體系的pH為5時，催化活性最佳。此外，MnO2納米酶耐極端溫度，在30-100℃范圍內(nèi)催化活性沒有明顯變化，表明MnO2納米酶比天然酶具有更高的耐溫性(圖2e)。根據(jù)酶動力學(xué)方程，可以定量評價MnO2 NSs的氧化酶活性。Km表示酶對底物的結(jié)合親和力，Vmax表示酶的周轉(zhuǎn)數(shù)，反映酶的生物催化活性。不同TMB濃度下MnO2 NSs的類氧化酶催化活性如圖2f所示。測得MnO2 NSs的Km和Vmax分別為0.447 mM和14.9 × 10-8 Ms-1。與先前報道的一些復(fù)合納米酶相比，MnO2 NSs的催化活性相當(dāng)，甚至更好。以上結(jié)果證明類氧化酶MnO2 NSs具有相對穩(wěn)定的催化性能，有利于構(gòu)建穩(wěn)定的MnO2納米酶介導(dǎo)的視覺生物傳感器。

要點：免疫層析分析的效果取決于合適的檢測條件。因此，在107 cfu?mL-1腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)溶液中，選擇MnO2 NSs的濃度和體積、孵育時間和免疫反應(yīng)時間作為關(guān)鍵檢測條件進行優(yōu)化。

要點：如圖直觀觀察到，在0 ~ 104 cfu?mL-1的檢測范圍內(nèi)，隨著細菌濃度的增加，T線上的棕色明顯加深。當(dāng)腸炎沙門氏菌濃度小于104 cfu?mL-1時，肉眼很難區(qū)分檢測區(qū)域的顏色變化。進一步，受納米酶介導(dǎo)的信號放大的啟發(fā)，現(xiàn)有的檢測結(jié)果被催化放大。催化后T線呈藍色，檢測范圍擴大10倍。獨立于其他設(shè)備，基于目測讀數(shù)的檢測限(LOD)在催化前后分別為104和103 cfu?mL-1，具有優(yōu)異的靈敏度，可以滿足現(xiàn)場檢測和快速讀數(shù)的需要。Image J軟件分析顯示，T線顏色強度與腸炎沙門氏菌濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，可表示為y = 1837.55x-6681.89 (R2 = 0.988)，可對目標(biāo)菌進行定量分析。在圖片中，催化產(chǎn)生的比色信號也與腸炎沙門氏菌濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系:y = 2009.80x-5102.21 (R2 = 0.979)。

為了驗證MnO2 NSs - ICA的特異性，對分析物與一系列干擾菌進行了交叉反應(yīng)試驗。如圖所示，雖然干擾菌的濃度(108 cfu?mL-1)比腸炎沙門氏菌的濃度(107 cfu?mL-1)高10倍，但這些干擾菌對應(yīng)的T線沒有明顯的信號。此外，在催化著色后，干擾菌株的T線仍無明顯信號，表明該新型生物傳感器對腸炎沙門氏菌具有良好的選擇性。

要點：為了驗證所開發(fā)的MnO2 NSs ICA的實際應(yīng)用，選取了幾個實際樣品進行了測試。如圖所示，對于不同的食品樣品，測試結(jié)果與緩沖系統(tǒng)中的測試結(jié)果一致。隨著細菌濃度的降低，T線棕色帶的強度逐漸變?nèi)?，直到分別在橙汁、飲用水、牛奶和牛肉的LOD濃度為104、104、104和105 cfu?mL-1時停止。在TMB催化著色后，上述樣品的LOD分別為103、103、103和104 cfu?mL-1，降低了10倍。

腸炎沙門氏菌免疫層析檢測的LOD為103 cfu?mL-1，線性范圍為103 -107 cfu?mL-1。ICA已成功應(yīng)用于橙汁、飲用水、牛奶、牛肉樣品中腸炎沙門氏菌的檢測。綜上所述，新型ICA在病原菌檢測中具有普遍適用性，具有制備工藝簡單、檢測速度快、經(jīng)濟、靈活、便于推廣應(yīng)用等優(yōu)點。遺憾的是，由于沒有控制線，該平臺可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，我們正在進行后續(xù)工作來彌補這一不足。