作者在CRISPR-RDB體系中采用了Cas12a，利用Cas12a在靶標識別后表現(xiàn)出的針對非特異單鏈DNA的反式剪切活性實現(xiàn)多重檢測。首先，作者設計了四條序列不同的Biotin-recognition DNA（recDNA I、II、III和IV），及其相應的序列互補的捕獲DNA（capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ）。recDNA I、II、III和IV分別與識別不同靶標序列的Cas12a/crRNA復合物孵育，形成單獨的反應單元。將待測樣本分別加入這4個反應單元，在對應靶標存在的情況下，Cas12a被激活并反式剪切recDNA；在對應靶標不存在的情況下，Cas12a不會被反式激活，相應的recDNA保持完整。反應結束后，將4個反應單元的產(chǎn)物混合，并與尼龍膜上包被的capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ孵育，完整的recDNA能與對應的capDNA互補結合，從而引入Biotin標記。Biotin標記的recDNA：capDNA雙鏈可以結合streptavidin-HRP，將無色的TMB底物轉化為藍色。因此，藍色指示對應靶標不存在；而白色指示對應靶標存在，且recDNA全部被反式剪切。

為了驗證CRISPR-RDB體系的可行性，作者先將4種recDNA和4種capDNA雜交，結果表明每條帶有4種capDNA的尼龍膜可識別到對應的recDNA，且recDNA I、II、III和IV之間沒有干擾。 同時，作者測試了4個具有不同靶標序列識別能力的Cas12a/crRNA系統(tǒng)，顯示能夠在特異靶標存在的情況下剪切對應的recDNA。

為了提升CRISPR-RDB體系的檢測性能，作者對其中的關鍵因素進行了優(yōu)化，確認尼龍膜承載體積（每個正方形尺寸為0.5 cm×0.6 cm）為1 μL；capDNA（1 μL，10 μM）和recDNA（75 nM）之間雜交條件為35℃，40 min；Cas12a濃度對為100 nM；HRP孵育時間為20 min。

在上述優(yōu)化的關鍵參數(shù)條件下，作者進一步測試了CRISPR-RDB體系的檢測性能。作者采用RPA預擴增的方案進行靶標富集，隨后用CRISPR-RDB體系對靶標濃度進行相對定量。如圖展示了針對4種靶標病毒的RPA引物和crRNA設計方案。隨后，對不同濃度（0、2.5、5、10、15、20 nM）靶標DNA進行檢測，隨著各靶標DNA濃度的增加，4個通道中的藍點強度相應地逐漸變?nèi)?。使用智能手機應用程序對一系列靶標DNA濃度進行相對量化，結果顯示在2.5–20 nM范圍內(nèi)具有良好的線性。進一步評估CRISPR-RDB對真實病毒樣品的檢測靈敏度，結果顯示對不同濃度（0、2、4、6、8、10和100個拷貝）FA、FA、RSV和SARS-CoV-2樣本有梯度檢測結果，且檢測限低至4個拷貝/μL。

為了探索CRISPR-RDB在真實臨床樣本中的應用，作者展示了工作流程圖。其從樣本到檢測結果的時長大約為105 min，檢測信號可以通過智能手機應用程序或肉眼來讀取。對23個臨床樣本進行檢測（1號：陰性對照；2–6號：FA陽性樣本；7–11號：FB陽性樣本；12–16號：新冠病毒陽性樣本；17–23號：呼吸道合胞病毒陽性樣本），并將檢測結果與qPCR對比，結果顯示，除19號樣本外，其它臨床樣本檢測結果一致。