近日，澳門(mén)大學(xué)的賈艷偉教授團(tuán)隊(duì)在權(quán)威期刊《Biosensors & Bioelectronics》上發(fā)表了一篇題為“Sub-5-Minute Ultrafast PCR using Digital Microfluidics”的文章，介紹了一種基于介電潤(rùn)濕數(shù)字微流控平臺(tái)的超快速PCR技術(shù)。該研究采用了多種創(chuàng)新策略，包括雙層加熱、多孔超疏水膜、隔溫槽以及可溶性化學(xué)溫度傳感器等，實(shí)現(xiàn)了液滴內(nèi)準(zhǔn)確的熱調(diào)節(jié)。這確保了在介電潤(rùn)濕數(shù)字微流控平臺(tái)上進(jìn)行PCR的效率和穩(wěn)定性，而且檢測(cè)靈敏度與傳統(tǒng)PCR相當(dāng)，僅需3.7-5分鐘。

為了減小傳感器與液滴實(shí)際溫度之間的偏差，研究團(tuán)隊(duì)采用了溫度敏感化學(xué)染料（磺酰羅丹明B，Sulforhodamine B，SRB）的水性溫度傳感器，對(duì)液滴內(nèi)溫度進(jìn)行準(zhǔn)確的校準(zhǔn)和調(diào)控。這一創(chuàng)新使得芯片上EWOD PCR的效率大大提高。由于傳統(tǒng)的單面加熱器加熱方案(MHS)會(huì)產(chǎn)生液滴內(nèi)垂直溫度差，影響PCR的效率，研究團(tuán)隊(duì)采用了頂部和底部雙層加熱方案（PHS），以減少熱損失、提高溫度均勻性。這一改進(jìn)有助于進(jìn)一步提高PCR的效率和穩(wěn)定性。

電場(chǎng)介電擊穿是影響電場(chǎng)介電噴射微流體PCR穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一。研究團(tuán)隊(duì)選用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作為電場(chǎng)介電層，由于PDMS對(duì)不均勻熱應(yīng)力的高耐受性，它能有效保護(hù)電極在高溫條件下不被擊穿。在微流控PCR中，氣泡的產(chǎn)生是一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題，它會(huì)導(dǎo)致液滴溫度不均勻，并可能中斷PCR的熱循環(huán)。為了解決這一問(wèn)題，研究采用了多孔膨體PTFE（ePTFE）覆蓋在半固化的PDMS上作為疏水層。這種微米級(jí)孔隙的ePTFE具有可膨化特性，在熱膨脹時(shí)不易發(fā)生表面破裂，從而抑制了因表面疏水層損傷而產(chǎn)生的氣泡。

研究還采用了移動(dòng)電極聯(lián)鎖排列技術(shù)，這一技術(shù)能夠降低移動(dòng)電極對(duì)液滴大小的限制，使得體積大于0.2 μL的液滴能在30℃以上的溫度差下連續(xù)移動(dòng)，且不受熱毛細(xì)管效應(yīng)的影響。

為了實(shí)現(xiàn)快速熱循環(huán)的PCR，研究在頂部加熱器周圍設(shè)置了隔熱槽，以擴(kuò)大變性和退火/延伸兩個(gè)區(qū)域之間的溫度差?；谏鲜黾夹g(shù)，液滴在新的集成電場(chǎng)介電噴射數(shù)字微流控系統(tǒng)上能穩(wěn)定地經(jīng)歷冷熱溫度區(qū)間的變化。這一系統(tǒng)在3.7分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了40個(gè)循環(huán)的超快PCR，比傳統(tǒng)的PCR方法快了10-17倍。

為了減少芯片上PCR的非特異性擴(kuò)增，研究團(tuán)隊(duì)在PCR配方中加入了可逆熱啟動(dòng)試劑（ThermaStop, TS）。這種試劑能夠防止在低溫下產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，并確保聚合酶在一定溫度以上完全恢復(fù)其活性?？紤]到芯片上PCR反應(yīng)體積較小，研究團(tuán)隊(duì)還優(yōu)化了聚合酶的濃度、芯片的基礎(chǔ)溫度以及液滴在變性區(qū)和退火/延伸區(qū)停留的時(shí)間，以提高整體效率。通過(guò)連續(xù)梯度稀釋實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了超快速PCR數(shù)字微流控芯片的靈敏度與傳統(tǒng)PCR相當(dāng)，其擴(kuò)增效率高達(dá)95.31%。

該數(shù)字微流控平臺(tái)采用微米級(jí)多孔ePTFE膜作為疏水層，以PDMS作為介電層。這種組合能有效抑制氣泡的形成和介電擊穿，顯著增強(qiáng)了EWOD芯片的耐用性。體積為0.6μL的超快EWOD PCR在短短3.7至5.0分鐘內(nèi)成功完成40個(gè)熱循環(huán)。這一創(chuàng)新為NAAT在感染性病原體檢測(cè)、耐藥性分子篩選、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域以及其他基于PCR的實(shí)際應(yīng)用提供了強(qiáng)大的支持。